Главная страница
Навигация по странице:

  • t 1 .

  • Из Ф. В. Тоукач, Центр ямр иох ран основы импульсной спектроскопии ямр


    Скачать 1.98 Mb.
    НазваниеИз Ф. В. Тоукач, Центр ямр иох ран основы импульсной спектроскопии ямр
    Анкорpulsenmr.doc
    Дата13.06.2018
    Размер1.98 Mb.
    Формат файлаdoc
    Имя файлаpulsenmr.doc
    ТипДокументы
    #18413
    КатегорияХимия


    из
    Ф.В. Тоукач, Центр ЯМР ИОХ РАН


    Основы импульсной спектроскопии ЯМР
    При помещении образца в магнитное поле снимается вырождение спиновых состояний ядер в этом образце. Часть ядер оказывается ориентирована “по полю” (состояние ), а другая часть - “против поля” (состояние ). Разница энергий этих состояний такова, что можно считать, что самопроизвольного перехода  не происходит, и распределение ядер по этим состояниям близко к 1:1. Если же облучать образец электромагнитной волной соответствующей частоты, то такие переходы будут наблюдаться (явление ЯМР), что выражается в поглощении энергии. Химическая значимость данного явления состоит в том, что ядра в образце находятся в немного различающихся магнитных полях из-за экранирования электронными оболочками других ядер (“химический сдвиг”) либо из-за наличия ядер-соседей с разными спинами, вносящими вклад в локальное магнитное поле (“спин-спиновое взаимодействие”), и поэтому резонансные частоты спиновых переходов ядер с разным химическим окружением различны. Зависимость количества ядер, в которых происходит резонансный переход, от величины энергии перехода называется “спектр ЯМР”.

    Простейший способ получения спектра ЯМР - помещение образца в постоянное магнитное поле и последовательное облучение всеми частотами, близкими к резонансной для данного типа ядер (“эксперимент с непрерывной частотной разверткой”). Тогда, когда какие-либо переходы в образце будут взаимодействовать с излучением, будет наблюдаться поглощение энергии. Недостаток данного метода состоит в том, что для разрешения двух линий с разницей, например, в 1 Гц, потребуется делать развертку со скоростью не более 1Гц/сек (из принципа неопределенности), следовательно для накопления спектра шириной 1КГц потребуется более 15 мин. Но есть и другой способ. Здесь уместно привести аналогию А. Дероума, в которой накопление спектра ЯМР рассматривается, как настройка колокола. В эксперименте с непрерывной разверткой мы воздействуем на колокол медленно изменяющейся звуковой частотой и в определенные моменты в колоколе возникают резонансные колебания, которые мы фиксируем микрофоном. Таким образом мы получаем зависимость силы отклика от частоты воздействия. Однако ни один настройщик, не лишенный музыкального слуха, так делать не будет. Он просто ударит по колоколу кувалдой, и в течении нескольких секунд услышит сразу все резонансные частоты одновременно. При этом у него в голове происходит гармонический анализ, результатом которого являются те же значения частот, на которых происходит отклик. Такой метод называется “импульсный эксперимент ЯМР”. В нем образец облучается мощным кратковременным импульсом на частоте, близкой к резонансной (чем короче этот импульс, тем большую полосу частот он возбуждает - опять же вследствие принципа неопределенности), а затем в течении некоторого небольшого времени записывается реакция образца (какая именно, будет рассмотрено ниже). В результате получается сумма синусоид, огибающая которой спадает экспоненциально (“спад свободной индукции”, FID - Free Induction Decay). Оказывается, FID (зависимость амплитуды от времени) и спектр ЯМР (зависимость амплитуды от частоты) связаны однозначной математической операцией (преобразование Фурье, FT), и являются разными представлениями одних и тех же процессов:



    Ðèñ. 1 FID è ñïåêòð ßÌÐ.

    Линии в спектре ЯМР всегда имеют конечную ширину (в методе с непрерывной разверткой это связано со скоростью изменения частоты, в импульсном методе - с тем, что в связи с релаксационными процессами, FID спадает до нуля через некоторое время, и чем быстрее он спадает, тем шире будут линии в его фурье-образе).



    Ðèñ. 3Ïðåöåññèÿ ìàãíèòíîãî ìîìåíòà ÿäðà.



    Ðèñ. 2Âåêòîð ìàêðîñêîïè÷åñêîé íàìàãíè÷åííîñòè.
    Теперь кратко рассмотрим процессы, происходящие в образце во время импульсного эксперимента. При помещении образца в магнитное поле, собственный магнитный момент каждого ядра начинает прецессировать вокруг оси магнитного поля (здесь и далее, это - ось 0z) наподобие гироскопа с частотой, зависящей от напряженности магнитного поля и типа ядер (Ðèñ. 3) (“Ларморова частота”1). Проекция этого момента на ось 0z остается постоянной. Фаза прецессии случайна, поэтому суммарная проекция объемной намагниченности образца на плоскость 0xy равна нулю, но отлична от нуля на оси 0z, так как в установившемся термическом равновесии более низкий энергетический уровень, соответствующий направлению магнитного момента ядра “по полю”, немного более заселен (Ðèñ. 2).




    Ðèñ. 4Âðàùàþùàÿñÿ ñèñòåìà êîîðäèíàò
    Таким образом в равновесном состоянии макроскопическая намагниченность образца направлена по оси 0z. Далее будем рассматривать намагниченность образца в системе координат, вращающейся вокруг оси 0z с ларморовой частотой (Ðèñ. 4).

    В этой системе координат исчезает прецессия магнитных моментов ядер и, следовательно, ее причина (постоянное магнитное поле), а тот самый импульс, который есть ничто иное, как включенное на короткое время переменное магнитное поле, осцилирующее в плоскости 0xy с ларморовой частотой, представляется вектором (B1), направленным по одной из горизонтальных осей вращающейся системы координат.

    Итак, когда включено переменное магнитное поле (импульс) два перпендикулярных вектора намагниченности (импульс и намагниченность образца) вызывают появление вращательного момента, который поворачивает вектор намагниченности образца вокруг оси, по которой направлен импульс (естественно, во вращающейся системе координат). Скорость этого поворота зависит от напряженности поля-импульса. Зная эту скорость, можно выключить переменное поле в нужный момент, повернув намагниченность образца на требуемый угол. На основании этого различают -, /2- и т.д. импульсы:



    Ðèñ. 5Âèäû èìïóëüñîâ.

    Другое различие может состоять в том, что импульсы бывают широкополосные (поворачивают намагниченность быстро; возбуждают сразу всю полосу частот резонанса каких-либо ядер) и селективные (поворачивают намагниченность медленно; возбуждают лишь какие-то определенные линии в спектре).

    Что же происходит после того, как импульс выключен? Если в спектре присутствует только одна линия, попадающая точно в резонанс, то вектор макроскопической намагниченности останется повернутым на тот угол, на который он был повернут, когда выключили импульс (здесь мы пока пренебрегаем явлениями релаксации). Для определенности будем считать, что использовался /2-импульс “положивший” вектор макроскопической намагниченности в плоскость 0xy:



    Ðèñ. 6Âîçäåéñòâèå èìïóëüñà íà íàìàãíè÷åííîñòü îáðàçöà.




    Ðèñ. 7Ïîñëå èìïóëüñà.
    Поскольку вектор макроскопической намагниченности неподвижен во вращающейся системе координат, в лабораторной системе координат мы будем наблюдать его биения в плоскости 0xy с частотой вращения системы координат. Проекции этих осцилляций на оси 0x и 0y как раз и фиксируются в виде FID’а. Если же есть линии, которые не попадают точно в резонанс (они есть всегда), то соответствующий им вектор макроскопической намагниченности начнет поворачиваться в плоскости 0xy вращающейся системы координат в сторону, зависящую от того, больше или меньше частота резонанса этих линий, чем ларморова (Ðèñ. 7). В лабораторной системе координат это отразится на частоте осцилляций соответствующей этим линиям синусоиды в FID’е, и следовательно, на положении линии в спектре ЯМР. Таким образом, для спектра ЯМР с несколькими разными линиями, вектор макроскопической намагниченности разделится на составляющие после его поворота в плоскость 0xy, и каждая из этих составляющих будет вращаться вокруг оси 0z вращающейся системы координат со скоростью, называемой “химическим сдвигом” данной линии (в первом приближении).

    Кроме рассмотренных процессов имеет место постепенное восстановление намагниченности обратно на ось 0z, в результате чего наблюдается экспоненциальный спад FID’а.

    Теперь, зная физическую основу, легко написать простейшую импульсную последовательность GO, состоящую из одного импульса и приводящую к регистрации одномерного спектра ЯМР: RD-PW-FIXD-AQ. Здесь RD - задержка для полной релаксации всех ядер, чтобы начинать любой эксперимент в равных условиях, PW - величина импульса (т.е. время, на которое нужно включить переменное поле), FIXD - задержка для переключения датчика на прием, AQ - регистрация FID’а. Данная последовательность повторяется нужное число раз (NS) для получения требуемого отношения сигнал/шум (оно растет пропорционально квадратному корню из числа сканов). Для усреднения и взаимоуничтожения возможных ошибок, существуют фазовые циклы, в рамках которых импульсы даются вдоль разных осей (x, y, -x, -y), а оси, проекции намагниченности на которые фиксируются в FID’е, тоже меняются, поэтому используется число сканов, кратное 8.




    Ðèñ. 8Ïðèíöèïèàëüíàÿ ñõåìà ñïåêòðîìåòðà ßÌÐ.
    Параметрами, определяющими “спектральное окно” (т.е. какую область снимать) являются ширина этого окна (SW) и его положение (O1) относительно частоты спектрометра по данным ядрам (SF). Реально, передатчик спектрометра ЯМР посылает опорную частоту (SF) в детектор, где она вычитается из снимаемого сигнала, чтобы снизить требования к АЦП (Ðèñ. 8). После оцифровки все сигналы (и шум), не попадающие в спектральное окно, все равно появятся в спектре, но в неправильных местах2, поэтому до АЦП расположен полосовой фильтр, который обнуляет все то, что находится за пределами заданного спектрального окна.




    Ðèñ. 9Õîðîøåå è ïëîõîå öèôðîâîå ðàçðåøåíèå.
    Скорость выборки данных аналогово-цифровым преобразователем (АЦП) определяется максимальной частотой, которую нужно оцифровать (SW; строго говоря O1+SW/2, но это не принципиально), и должна превышать ее по крайней мере в два раза (критерий Найквиста). Время накопления одного скана (AQ) равно TD/2SW, где TD - размер массива, в который производится запись (иначе говоря, число выбираемых за один скан точек). Следует иметь в виду, что отношение SW/TD определяет цифровое разрешение (Гц/тчк), которое, также, как и физическое, влияет на качество спектра ЯМР (Ðèñ. 9).

    Из параметров, относящихся к накоплению, стоит также упомянуть величину усиления в канале приемника (RG). Она должна быть подобрана так, чтобы самый интенсивный сигнал как раз исчерпал весь динамический диапазон АЦП, но не превысил его (если задать слишком большое RG (Рис. 10), зашкаливание АЦП вызовет искажения базовой линии, а слишком маленькое RG негативно сказывается на отношении сигнал/шум).

    После того, как FID накоплен, стоит освободить спектрометр для следующего эксперимента, а тем временем заняться математической обработкой полученных данных. Преобразование Фурье (FT) - комплексная операция. Фазовые сдвиги между частотами в FID’е приводят к смешиванию действительной и мнимой частей его фурье-образа (спектра ЯМР):






    Ðèñ. 10
    Èñêàæåíèÿ ñïåêòðà èç-çà ñëèøêîì áîëüøîãî RG.


    Ðèñ. 11Äåéñòâèòåëüíàÿ è ìíèìàÿ ÷àñòè ñïåêòðà.

    Получающиеся при этом фазовые искажения сигналов, которые исправляются простыми математическими средствами. Если фаза какого-то из сигналов выставляется неправильно, а весь остальной спектр фазируется нормально, вероятно это - сигнал, отраженный от края спектрального окна, появившийся из-за несовершенства полосового фильтра.

    Рассмотрим несколько математических операций, которые можно провести перед преобразованием Фурье. В большинстве случаев “хвост” FID’а практически не содержит сигнала, поэтому можно безболезненно дописать к нему нули (Рис. 14), не опасаясь возникновения “ступеньки”. Дополнение нулями увеличит количество точек, не изменяя при этом информации, содержащейся в FID’е, что может сделать спектр визуально более разрешенным. Если же, наоборот, накопление было прекращено раньше, чем FID’а спал до нуля, то во избежание появления виглей у сигналов, ступеньку необходимо сгладить (“аподизация”, Рис. 13).





    Ðèñ. 12 Îáðåçàíèå FID’à.



    Ðèñ. 13 Àïîäèçàöèÿ.



    Ðèñ. 14 Äîïîëíåíèå íóëÿìè.


    Поскольку большая часть сигналов находится в начальной части FID’а, умножив его на спадающую экспоненту, можно ослабить вклад “хвоста”, в котором больше шума, чем сигналов, и тем самым, улучшить отношение сигнал/шум (Рис. 15). Платой за это является уширение линий. Такой прием называется “экспоненциальное умножение”. Можно достигнуть и обратного эффекта, увеличив вклад “хвоста” (“преобразование лоренцевой формы линии в гауссову”, Рис. 16) - правильно подбирая параметры взвешивающей функции, на которую умножается FID, можно сильно улучшить разрешенность спектра, несмотря на ухудшение отношения сигнал/шум.



    Ðèñ. 15 Óìíîæåíèå íà ýêñïîíåíòó



    Ðèñ. 16 Ïðåâðàùåíèå ëîðåíöåâîé ëèíèè â ãàóññîâó.





    Ðèñ. 17Âîçìîæíûå îøèáêè ïðè íàñòðîéêå ðàçðåøåíèÿ.
    К сожалению, форму линии практически невозможно скорректировать, если спектр уже снят - об этом нужно заботиться на этапе настройки спектрометра ЯМР для каждого конкретного образца. Настройка подразумевает подбор величин токов в так называемых градиентных катушках, которые создают небольшие магнитные поля, корректирующие основное поле. Поля, создаваемые этими катушками, могут быть ориентированы по осям x, y и z, и меняться в пространстве по различным законам, например: z, z2, xy, x, x2-y2 и т.д. Поскольку значения токов в одних катушках влияют на величины оптимальных значений в других, настройка разрешения (т.е. поиск глобального минимума функции нескольких переменных) трудно алгоритмизируема. Это связано также с тем, что для оценки результата должно пройти относительно большое (по машинным меркам) время. Качество настройки разрешения оценивается, в первом приближении, по высоте сигнала дейтерия (чем он выше, тем он тоньше при той же площади), который все время накапливается одновременно с сигналом исследуемых ядер. Это параллельное накопление нужно для того, чтобы автоматика спектрометра (“система дейтериевой стабилизации”, lock) имела возможность наблюдать на частотой этого сигнала и подстраивать поле так, чтобы она не менялась. Градиентные катушки обеспечивают однородность магнитного поля в объеме образца, а система дейтериевой стабилизации - однородность поля во времени.

    На Ðèñ. 17 приводятся характерные дефекты формы линии, вызванные ошибками в настройке разрешения. В реальности, конечно, все эти ошибки смешиваются в разных пропорциях.

    Если разные линии искажены по-разному, то дело, скорее всего, в плохой гомогенности образца, градиенте концентрации в ампуле или неравномерном нагреве.




    Ðèñ. 18Øèðîêîïîëîñíàÿ ðàçâÿçêà
    Разрешение наиболее важно для протонных спектров, а при работе с другими ядрами основной проблемой, как правило, становится чувствительность. Если не требуется решать специальные задачи, съемка спектров ЯМР по малочувствительным ядрам проводится с широкополосной развязкой от области резонанса протонов. Это значит, что одновременно с импульсом возбуждающим переходы в исследуемых ядрах, генерируется второй импульс на частоте протонов (Ðèñ. 18). Этот второй импульс выравнивает заселенности спиновых уровней всех протонов и, следовательно, подавляет спин-спиновое взаимодействие с ними, поэтому мы не наблюдаем спин-спинового расщепления в спектрах по другим ядрам, например, 13С. Кроме этого, облучение протонов инициирует гетероядерный NOE, что также увеличивает интенсивность сигналов.

    Второй импульс генерируется устройством “декаплер” и может быть как широкополосным, так и селективным. Он может использоваться и для протонных экспериментов - в этом случае возможность облучать образец двумя разными импульсами приводит к целой гамме различных экспериментов.

    Рассмотрим следующую импульсную последовательность: /2-t1-/2-AQ(t2), где t1 - переменная задержка (Ðèñ. 19). После первого импульса намагниченность образца, соответствующая линии с химическим сдвигом , начинает прецессировать в плоскости 0xy со скоростью  Гц. За время t1 она успевает повернуться на некоторый угол, что ведет к возникновению ненулевой проекции на ось, вокруг которой первый импульс повернул вектор макроскопической намагниченности. В этот момент генерируется второй импульс, который поворачивает намагниченность еще на четверть оборота. При этом проекция на ось 0x, вокруг которой происходит поворот, естественно, не изменяется, зато проекция на ось 0y, будучи повернутой на ось 0z, исчезает. Если после второго импульса произвести накопление, то фактически мы накопим ту часть сигнала, которая успела возникнуть на оси 0x за время t1.



    Ðèñ. 19Èìïóëüñíàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü COSY

    Амплитуда этого сигнала будет совершать осцилляции в зависимости от t1. Посмотрим “сбоку” на вершину этого сигнала: зависимость ее положения от t1 есть ни что иное, как FID:



    Ðèñ. 20Àìïëèòóäíàÿ ìîäóëÿöèÿ ñèãíàëà â çàâèñèìîñòè îò t1.

    Если сделать его преобразование Фурье, то мы получим как раз линию на той же частоте . Большей общности можно достигнуть, преобразуя не только максимумы сигналов, а все столбцы точек. Это равнозначно двумерному преобразованию Фурье, результатом которого является двумерный спектр ЯМР - функция переменных t1 и t2:



    Ðèñ. 21Ðåçóëüòàò äâóìåðíîãî ïðåîáðàçîâàíèÿ Ôóðüå

    Если спектр ЯМР содержит две линии, связанные спин-спиновым взаимодействием, то второй импульс перераспределяет заселенности энергетических уровней всех возможных переходов в рамках спиновой системы. Передача возмущения от облучаемого перехода на все остальные подобна переносу поляризации в экспериментах типа SPI или INEPT, только здесь это происходит в гомоядерном варианте. Данный эксперимент называется COSY (от COrrelation SpectroscopY), так как его результат показывает все спин-спиновые взаимодействия. На Ðèñ. 22 представлен спектр COSY системы AX, содержащей спиновую связь:


    Ðèñ. 22Ñïåêòð COSY ñèñòåìû AX

    версия документа 2001 Sep 5

    1 Ëàðìîðîâà ÷àñòîòà äëÿ ïðîòîíîâ íàçûâàåòñÿ ðàáî÷åé ÷àñòîòîé ñïåêòðîìåòðà ßÌÐ.

    2 Äîêàçàòåëüñòâî ýòîãî óòâåðæäåíèÿ ïðîâåäåíî Íàéêâèñòîì è âûõîäèò çà ðàìêè äàííîãî ïîñîáèÿ. Ïîâåðüòå ìíå, ýòî î÷åíü ïðîñòî!
    написать администратору сайта